在前两期的推送稿中，我们为大家介绍了宏基因组组装的基本原理和操作。基于组装序列，我们可以实现基因预测、物种注释、功能注释等相关分析，从而研究微生物菌群结构、菌属功能及作用机制。因此，本期我们将从基因预测的原理和操作两个部分出发，为大家介绍基于组装序列的基因预测。
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基因预测原理
宏基因组基因预测一般包括同源预测和从头预测。同源预测是通过与基因的同源序列比对，从而获得与已知基因序列最大匹配，其预测依赖于已知的基因信息，且不能注释出在数据库中缺少功能相似性序列的基因和新基因，计算资源消耗过大，时间花费过长。而从头预测是根据给定的序列特征来预测，主要依赖于在编码区和非编码区拥有不同特征的信息，并在统计学上进行描述，构建概率模型，用以区别编码与非编码区。从头预测能够预测出已知的和未知的基因，且计算资源消耗小，时间花费少，常用软件包括：GeneMark，MetaGeneMark，MetaGene等。本期我们主要通过基于从头预测原理的MetaGeneMark来预测基因。
预测过程包括
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基因预测实现
（1）软件
MetaGeneMark（预测的范围是细菌和古菌），下载地址：
http://exon.gatech.edu/license_download.cgi。
CD-HIT去除冗余序列，下载地址：http://www.bioinformatics.org/cd-hit。
（2）输入文件
SOAPdenovo-63mer对单个样本进行组装后，筛选出长度不小于500bp的scaftigs，得到结果文件sample1.cut500.scafSeq，sample2.cut500.scafSeq，sample3.cut500.scafSeq；SOAPdenovo-63mer对所有样本进行混合组装，筛选出长度不小于500bp的scaftigs，得到结果文件mix.cut500.scafSeq。文件格式如图所示，包括scaffold编号，长度及序列信息。
（3）基因预测
基于单个样本的基因预测
gmhmmp -a -d -f G -m MetaGeneMark_v1.modsample1.cut500.scafSeq -A sample1_protein.fasta -D sample1_nucleotide.fasta
gmhmmp -a -d -f G -m MetaGeneMark_v1.modsample2.cut500.scafSeq -A sample2_protein.fasta -D sample2_nucleotide.fasta
gmhmmp -a -d -f G -m MetaGeneMark_v1.modsample3.cut500.scafSeq -A sample3_protein.fasta -D sample3_nucleotide.fasta
基于混合组装的基因预测
gmhmmp -a -d -f G -m MetaGeneMark_v1.modmix.cut500.scafSeq -A mix_protein.fasta -D mix_nucleotide.fasta
参数说明：
-a 显示预测得到的基因的蛋白序列
-A 蛋白序列输出文件
-d 显示预测得到的基因的核酸序列
-D 核酸序列输出文件
-f显示输出格式，L=LST，G=GFF
-m 用于基因预测的模型文件，MetaGeneMark提供的MetaGeneMark_v1.mod适用于宏基因组预测
（4）基因去冗余
A. 将上一步得到的所有核酸序列（sample1_nucleotide.fasta，sample2_nucleotide.fasta，sample3_nucleotide.fasta，mix_nucleotide.fasta）合并成一个核酸序列total.gene.nucl.fasta; 将所有蛋白序列合并成一个total.gene.prot.fasta。
B. 蛋白质序列去冗余：
cd-hit-c 0.9 -n 5 -M 1600 -d 0 -T 8 -i total.gene.prot.fasta -o NonRundant.gene.prot.fasta
参数说明：
-c 相似性阈值，默认值为0.9
-n word长度值，基于word filter方法使用不同word长度值产生的去冗余水平不同，例如长度为2的word得到相似性在50%以上的序列，长度为3的word得到相似性在66.7%以上的序列
-M 分配的内存
-d 聚类信息文件中序列名长度，0代表显示完整序列名。
-T 线程数
-i 输入文件，fasta格式
-o 输出文件前缀，有两个输出文件，分别为fasta格式和以.clstr结尾的聚类信息文件。
输出文件：去冗余后的fasta格式文件NonRundant.gene.prot.fasta；以.clstr结尾的聚类信息文件NonRundant.gene.prot.fasta.clstr（见下图）。
注：每一个聚类组以“>”区分，且每个聚类组有不同的聚类序列，每个聚类序列中百分比代表该序列与代表序列的相似度，“*”代表该序列即为代表序列。
C. 核酸序列去冗余：
由于不同的核酸序列翻译后可能产生相同的蛋白质序列，因此对核酸序列的去冗余需要基于蛋白质序列。具体做法是：基于蛋白质序列文件与核酸序列文件中序列号的对应关系，根据去冗余后的蛋白质序列文件的序列号筛选核酸序列。
（5）基因丰度计算
使用soap将clean data比对到非冗余的核酸序列NonRundant.gene.nucl.fasta。根据soap比对结果，获得比对到某基因的read数。Soap比对工具的使用在之前的微信推送稿中介绍过，这里就不做说明。然后，基于read数获得基因的丰度值，计算方法如下：
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S1 |
S2 |
S3 |
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G1 |
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G2 |
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G3 |
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样本i中基因j表示为SiGj, 样本i中比对到基因j的read数表示为SiGj_read，基因j长度表示为Gj_len。
SiGj丰度值=（SiGj_read/Gj_len）/（SiG1_read/G1_len+SiG2_read/G2_len+SiG3_read/G3_len ...）
宏基因组基于组装的基因预测就介绍到这里，大家可以动起手来试一试，在下面一期小编将为大家带来宏基因组物种注释和功能注释部分，敬请期待！
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