ATAC-Seq分析教程：用MACS2软件call peaks—科研必备表观遗传学知识

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学习目标：

学会用MACS2 call peaks
了解MACS2 call peaks的成果

Peak Calling

Peak calling即运用核算的办法找出ChIP-seq或ATAC-seq中reads富集的基因组区域。

如下图所示，比对成果的文件中reads在正负链不均匀分布，但在结合位点聚集。正负链5‘末端的reads各形成一组合，通过统计学的办法评估这些组合的分布并和对照组比较，确认这些结合位点是否是明显的。

NOTE：ChIP-seq的剖析办法能够判定两种类型的富集模式：broad domains和narrow peaks。broad domains，如组蛋白润饰在整个基因body区域的分布；narrow peak，如转录因子的结合。narrow peak相对于broad 或者分散的marks更易被检测到。也有一些混合的结合图谱，如PolII包括narrow和broad信号。

MACS2

peaks calling 有不同的办法，MACS2是最常用的call peaks东西。 MACS全称Model-based Analysis of ChIP-Seq，开始的设计是用来判定转录因子的结合位点，可是它也能够用于其他类型的富集方式测序。
MACS通过整合序列标签方位信息和方向信息进步结合位点的空间分辨率。MACS的工作流如下所示：

MACS2的运用办法

了解相关参数：

输入文件参数：

-t:实验组，IP的数据文件
c: 对照组
f：指定输入文件的格局，默认是自动检测输入数据是什么格局，支撑bam,sam,bed等
g:有用基因组巨细，因为基因组序列的重复性，基因组实践能够mapping的巨细小于原始的基因组。这个参数要根据实践物种核算基因组的有用巨细。软件里也给出了几个默认的-g 值：hs – 2.7e9表明人类的基因组有用巨细(UCSC human hg18 assembly).
- hs: 2.7e9
- mm: 1.87e9
- ce: 9e7
- dm: 1.2e8

输出文件参数：

--outdir:输出成果的存储途径
-n:输出文件名的前缀
-B/--bdg:输出bedgraph格局的文件，输出文件以NAME ’_treat_pileup.bdg’ for treatment data, NAME ’_control_lambda.bdg’ for local lambda values from control显现。

peak calling 参数

-q/--qvalue 和 -p/--pvalue
q value默认值是0.05，与pvalue不能同时运用。
--broad
peak有narrow peak和broad peak, 设置时能够call broad peak 的成果文件。
--broad-cutoff
和pvalue、以及qvalue相似
--nolambda: 不要考虑在峰值候选区域的局部偏差/λ

q值与峰宽有必定的联络。抱负情况下，假如放宽阈值，您将简单地取得更多的peaks，可是运用MACS2放松阈值也会导致更宽的peaks。

Shift 模型参数：

--nomodel
这个参数和extsize、shift是配套运用的，有这个参数才能够设置extsize和shift。
--extsize
当设置了nomodel时，MACS会用--extsize这个参数从5’->3’方向扩展reads修复fragments。比如说你的转录因子结合规模200bp，就设置这个参数是200。
--shift
当设置了–nomodel，MACS用这个参数从5’ 端移动剪切，然后用–extsize延伸，假如–shift是负值表明从3’端方向移动。建议ChIP-seq数据集这个值坚持默认值为0，对于检测富集剪切位点如DNAsel数据集设置为EXTSIZE的一半。
示例：

想找富集剪切位点，如DNAse-seq，一切5’端的序列reads应该从两个方向延伸，假如想设置移动的窗口是200bp，参数设置如下：
--nomodel --shift -100 --extsize 200
对nucleosome-seq数据，用核小体巨细的一半进行extsize,所以参数设置如下：
--nomodel --shift 37 --extsize 73

--call-summits
MACS运用此参数重新剖析信号谱，解析每个peak中包括的subpeak。对相似的结合图谱，引荐运用此参数，当运用此参数时，输出的subpeak会有相同的peak边界，不同的绩点和peak summit poisitions.

ATAC-Seq call peaks示例

ATAC-seq关心的是在哪切断，断点才是peak的中心，所以运用shift模型，–shift -75或-100
对人细胞系ATAC-seq 数据call peak的参数设置如下：

macs2 callpeak -t H1hesc.final.bam -n sample --shift -100 --extsize 200 --nomodel -B --SPMR -g hs --outdir Macs2_out 2> sample.macs2.log

MACS2输出文件解读

NAME_peaks.xls
包括peak信息的tab切割的文件，前几行会显现callpeak时的命令。输出信息包括：
- 染色体号
- peak开始位点
- peak结束位点
- peak区域长度
- peak的峰值位点（summit position）
- peak 峰值的高度（pileup height at peak summit, -log10(pvalue) for the peak summit）
- peak的富集倍数（相对于random Poisson distribution with local lambda）
  
  Coordinates in XLS is 1-based which is different with BED format
  XLS里的坐标和bed格局的坐标还不相同，开始坐标需求减1才与narrowPeak的开始坐标相同。
NAME_peaks.narrowPeak
*narrowPeak文件是BED6 4格局，能够上传到UCSC阅读。输出文件每列信息别离包括：
- 1；染色体号
- 2：peak开始位点
- 3：结束位点
- 4：peak name
- 5：int(-10*log10qvalue)
- 6 ：正负链
- 7：fold change
- 8：-log10pvalue
- 9：-log10qvalue
- 10：relative summit position to peak start（？）
NAME_summits.bed
BED格局的文件，包括peak的summits方位，第5列是-log10pvalue。假如想找motif，引荐运用此文件。
Remove the beginning track line if you want to analyze it by other tools.???
- .bdg
  bedGraph格局，能够导入UCSC或者转换为bigwig格局。两种bfg文件：treat_pileup, and control_lambda.
NAME_peaks.broadPeak
BED6 3格局与narrowPeak相似，只是没有第10列。

summits.bed，narrowPeak，bdg, xls四种类型输出文件的比较：

xls文件
文件包括信息还是比较多的，和narrowPeak唯一不同的是peak的开始方位需求减1才是bed格局的文件，另外还包括fold_enrichment 和narrowPeak的fold change 对应，-log10pvalue,-log10qvalue,peak长度，peak 峰值方位等。
narrowPeak文件
和xls文件信息相似
summits.bed文件
包括峰的方位信息和-log10pvalue
bdg文件
bdg文件合适导入UCSC或IGV进行谱图可视化，或者转换为bigwig格局再进行可视化。