RNA-Seq分析|RPKM, FPKM, TPM, 软件比对|实例解析

在RNA-Seq的分析中，对基因或转录本的read counts数目进行标准化（normalization）是一个极其重要的步骤，因为落在一个基因区域内的read counts数目取决于基因长度和测序深度。很容易理解，一个基因越长，测序深度越高，落在其内部的read counts数目就会相对越多。当我们进行基因差异表达的分析时，往往是在多个样本中比较不同基因的表达量，如果不进行数据标准化，比较结果是没有意义的。因此，我们需要标准化的两个关键因素就是基因长度和测序深度，常常用RPKM (Reads Per Kilobase Million), FPKM (Fragments Per Kilobase Million) 和 TPM (Trans Per Million)作为标准化数值。那么，这三者计算原理是什么，有何区别呢？

下面做详细介绍。

为了更清楚的展示计算过程，我们用三个样本的4个基因的read counts矩阵做例子（来源于YouTube）。如表1：

Gene Name	Sample1 Counts	Sample2 Counts	Sample3 Counts
A (2kb)	10	12	30
B (4kb)	20	25	60
C (1kb)	5	8	15
D (10kb)	0	0	1

大家可以清楚地看到，样本3的4个基因read counts数目明显多于其他两个样本，说明其测序深度较高，基因B的长度是基因A的两倍，也使得其read counts在三个样本中都高于A。接下来我们要做就是对这个矩阵进行标准化，分别计算RPKM, FPKM和TPM, 请睁大你的眼睛（为了使数值可读性更好，下面的计算中我们用10代表million）。

我们先来说说RPKM怎么算。第一步先将测序深度标准化，计算方法很简单，先分别计算出每个样本的总reads数（这里以10为单位），然后将表中数据分别除以总reads数即可，这样就得到了reads per million. 如下表2：

Gene Name	Sample1 Counts	Sample2 Counts	Sample3 Counts
A (2kb)	2.86	2.67	2.83
B (4kb)	5.71	5.56	5.66
C (1kb)	1.43	1.78	1.42
D (10kb)	0	0	0.09

第二步即是基因长度的标准化了。将表2的read per million直接除以基因长度即可，如表3：

Gene Name	Sample1 Counts	Sample2 Counts	Sample3 Counts
A (2kb)	1.43	1.33	1.42
B (4kb)	1.43	1.39	1.42
C (1kb)	1.43	1.78	1.42
D (10kb)	0	0	0.009

到这里，我们即得到了传说中的RPKM。

FPKM和RPKM的定义是相同的，唯一的区别是FPKM适用于双端测序文库，而RPKM适用于单端测序文库。FPKM会将配对比对到一个片段（fragment）上的两个reads计算一次，接下来的计算过程跟RPKM一样。

下面，终于轮到TPM登场了。虽然同样是标准化测序深度和基因长度，TPM的不同在于它的处理顺序是不同的。即先考虑基因长度，再是测序深度。我们仍以表1的那个例子来说明TPM是计算过程。

第一步直接除以基因长度，得到reads per kilobase，如表4：

Gene Name	Sample1 Counts	Sample2 Counts	Sample3 Counts
A (2kb)	5	6	15
B (4kb)	5	6.25	15
C (1kb)	5	8	15
D (10kb)	0	0	0.1

第二步标准化测序深度时，总的reads数要用第一步中除过基因长度的数值。即第一样本除以15，第二个样本除以20.25，第三个样本除以45.1 （别忘了我们的单位是10哦）。表5就是你们想要的TPM了。

Gene Name	Sample1 Counts	Sample2 Counts	Sample3 Counts
A (2kb)	3.33	2.96	3.326
B (4kb)	3.33	3.09	3.326
C (1kb)	3.33	3.95	3.326
D (10kb)	0	0	0.02

下面，是考验你们数学功底的时候了，有没有看出来TPM分分钟完虐FPKM/RPKM？其实，只要我们在表3和表5下面多加一行你就能很轻松地看到区别了。

RPKM

Gene Name	Sample1 Counts	Sample2 Counts	Sample3 Counts
A (2kb)	1.43	1.33	1.42
B (4kb)	1.43	1.39	1.42
C (1kb)	1.43	1.78	1.42
D (10kb)	0	0	0.009
Total	4.29	4.5	4.25

TPM

Gene Name	Sample1 Counts	Sample2 Counts	Sample3 Counts
A (2kb)	3.33	2.96	3.326
B (4kb)	3.33	3.09	3.326
C (1kb)	3.33	3.95	3.326
D (10kb)	0	0	0.02
Total	10	10	10