【一作解读】大样本转录组学怎么发高分文章

发表期刊：Plant Biotechnology Journal

发表时间：2020年7月12

影响因子：8.1

研究内容：棉花花芽分化

研究对象：两个早熟品种，两个晚熟品种；每个品种6个时期

研究方法：转录组测序

研究题目：高分辨率时空动态转录组揭示陆地棉中GhCAL介导的开花调控途径

前言

陆地棉( Gossypium hirsutum L.) 是世界上最重要的纤维作物。在我国黄河流域和长江流域棉区，实现早熟棉在小麦或者油菜后直播可以提高复种指数。而在西北内陆棉区，春季气温低，秋季枯霜早，早熟棉既能提高棉花的霜前花率，还可以改善棉花品质。花芽分化是影响短季棉品种早熟的重要性状，是棉花现蕾期、开花期和成铃期发育的基础，花芽分化直接影响开花时间。花芽分化是植物从营养生长向生殖生长过渡的标志。当进入生殖生长时，侧芽变成花芽，花芽发育成果枝。果枝分化决定了开花量、生殖能力和棉花产量。因此，早熟性状及早熟棉品种在生产上显得尤为重要。

结果

1、棉花茎尖的形态发育

在这项研究中，选择了两个早熟的陆地棉栽培品种CCRI50 和Yanzao2，以及两个晚熟的栽培品种国新棉11和STS458 。与晚熟品种相比，早熟品种的花芽分化时间提前了10 天，开花时间提前了19天，整个生长期缩短了33天（图1a ）。石蜡切片的组织学分析表明，在早熟品种Yanzao2 和CCRI50中，花芽分化出现在第三片真叶展平时期（3TLS ），而晚熟品种在第五真叶（5TLS ）才出现花芽分化。

图1 两个早熟品种和两个晚熟品种的比较

2、棉花不同发育阶段的72 个RNA文库的转录组谱

在这里，为了研究棉花早期成熟调控网络的分子机制，我们选择了两个早熟品种和两个晚熟品种，在花芽分化前后收集了茎尖样品，并分析了它们的转录动态。发现至少一个样品中表达的基因共有49 000 个。为了了解早熟和晚熟棉花品种发展的转录动态，对所有样品进行了聚类分析（图2a）和主成分分析（PCA）（图2b）。结果表明，这些高密度时空转录本可以根据发育阶段分为两个类群，然后在每个类群中将早熟和晚熟品种分开。

图2早熟和晚熟品种六个发育阶段之间的转录关系。

3、加权基因共表达网络分析（WGCNA ）

将5312个基因用于 WGCNA，产生 10个不同的模块（标有不同的颜色）（图 3a， b）。几乎 80％的基因聚集在发育阶段的模块中（ MEcyan， Megreen， MElightgreen， MEtan， MEsalmon和 MEturquoise）（图 3b）。这些基因的动态和阶段或品种特异性表达模式可能反映了它们发挥的关键功能。

图3 差异表达基因的WGCNA

4、棉花从营养生长向生殖生长转换相关基因的鉴定

MElightcyan 模块包含46个基因，其中包括29个转录因子。这些基因的表达模式与花芽分化阶段相吻合，在3TLS时表达，并且两个早熟品种中这些基因的表达水平始终高于两个晚熟品种中的表达水平（图4a）。在这个模块中，GH_D07G0876 的连接线（边缘）数量最多，这是AtCAL基因的同源基因，命名为GhCAL （图4c）。

图4 模块MElightcyan 的分析

5、GhCAL 在调节从营养生长到生殖生长的转换的功能验证

GhCAL过表达能够使拟南芥显著早花。GhCAL 沉默的转基因棉花显著晚花，花芽分化与野生型相比显著推迟。GhCAL 表达的下降延迟了棉花从营养生长到生殖生长的过渡。

6、病毒诱导的 GhAGL6-D09 和 GhAP1-A04 沉默导致棉花开花延迟

为了探索GhCAL 如何调节棉花开花，分析了以GhCAL为中心的WGCNA基因网络中具有更多连接线（边缘）的其他基因的表达。编码AGL6同源基因的GH_D09G0468和编码AP1同源基因的GH_A04G1749分别被命名为GhAGL6-D09和GhAP1-A04。在GhCAL沉默的转基因棉花品系中，GhAGL6-D09 和GhAP1-A04的表达明显较低，这可能是由于GhCAL表达的降低导致的，表明AGL6 和AP1受GhCAL调控。GhAGL6-D09和GhAP1-A04 过表达能够使拟南芥开花时间明显提前。同时，GhAGL6-D09和GhAP1-A04沉默的棉花植株与对照相比，花芽分化和开花时间显著推迟。

7、GhCAL-D07能够与GhAGL6-D09 / GhAP1-A04 形成异源二聚体

先前的研究表明，某些MADSbox 转录因子可能形成异二聚体以发挥调节作用。酵母双杂交（Y2H ）和双分子荧光互补（BiFC）分析表明，GhCAL，GhAGL6-D09和GhAP1-A04这三种蛋白质彼此相互作用，形成异二聚体。在拟南芥中，MADS-box转录因子可以形成特异性异二聚体，该异源二聚体与自身启动子区域的CArG-box结合并调节其自身表达。GhCAL可能与GhAGL6-D09和GhAP1-A04形成异源二聚体，结合启动子区域的CArG-box，然后调节它们的表达。

8、GhCAL通过调节 GhAP1A04和 GhAGL6-D09介导棉花营养生长向生殖生长转换的调控途径

在早熟品种中，GhCAL 在3TLS 表达。GhCAL与GhAGL6-D09形成异二聚体，可能与GhAGL6-D09启动子区域的CArG-box结合并诱导GhAGL6-D09的表达以启动花芽分化。在5TLS时，GhCAL / GhAGL6与GhAP1-A04形成异二聚体，可能与GhAP1-A04启动子区域的CArG-box结合并诱导GhAP1-A04的表达。GhCAL充当整个途径的调节中心，调节棉花从营养期到生殖期的过渡，以诱导开花。