Nature Methods：让长读长测序来拯救基因组组装

自测序技术问世以来，利用 DNA 序列的片段来组装人类、动植物或微生物的基因组就一直是难题。许多参考基因组都存在缺陷，如组装错误或存在缺口。人类参考基因组 GRCh38 就有数百个缺口，缺失了大约 150 Mb 的序列。

随着高精度长读长测序技术的出现，这种状态正在改变。《Nature Methods》杂志上近日发表了一篇题为 “Long road to long-read assembly” 的文章，介绍了基因组组装项目如何受益于这种技术。

填补缺口

文章作者 Vivien Marx 指出，填补基因组上的缺口可以帮助人们比较基因组之间的差异。这些方法不仅适用于人类基因组，也适用于其他生物，比如微生物和脊椎动物。去年，“端粒到端粒联盟（T2T）” 成员公布了激动人心的新进展。他们利用 CHM13hTERT 细胞系，组装了 X 染色体和 8 号染色体的完整序列。

CHM13 细胞来源于葡萄胎，具有单倍体人类基因组。联盟负责人之一 Adam Phillippy 表示：“当我们只需要组装一个基因组而不是两个基因组时，问题就大大简化了。” 如今，他们已经几乎完成了整个 CHM13 基因组的组装，只剩下五个缺口。下一步打算完成二倍体人类基因组的从端粒到端粒组装。“从单倍体到二倍体，听起来并不困难，但实际上要复杂得多，” 他说。

对付着丝粒

着丝粒一直是极具挑战性的区域。在 X 染色体上，着丝粒的基本重复单元的长度为 171 bp，而其串联重复序列正是 12 个单元的组合，长度约为 2 kb。因为不容易克隆，这些卫星 DNA 的序列很难获得。T2T 联盟另一名负责人 Karen Miga 表示，一些新的测序技术可以帮助他们实现目标，比如 Oxford Nanopore 和 Pacific Biosciences。

测序之后还需要组装。将着丝粒及其重复序列组装起来，有点像在玩一块蓝天的拼图，简直让人无从下手。丹纳法伯癌症研究所 Heng Li 实验室开发出了基因组组装工具 hifiasm，能够对付着丝粒。同时，加州大学圣地亚哥分校的 Pavel Pevzner 实验室最近也开发出了组装着丝粒的算法 centroFlye。他表示，centroFlye 是 “通过在蓝天中寻找一小片白云来进行组装”。

长长长读长

Pacific Biosciences 和 Oxford Nanopore 都推出了长读长测序技术，读长超过了 10 kb。以往的数据显示，这些技术很容易出错，但 Phillippy 认为，现在的情况已经大不相同。PacBio 在 2019 年推出了基于环状共有序列（CCS）的测序模式，生成了高度准确的 HiFi reads。他表示，这种技术在检测单个分子上的准确性高达 99.9%。同时，与五年前相比，纳米孔测序的准确度也大大提高。

Pevzner 认为，这两种技术都可以达到 90% 以上的准确度。“HiFi reads 的错误率是每一千个核苷酸有几个错误。纳米孔的超长测序虽然没那么准确，但成本也较低。这种情况正在动态变化。” 生物学家目前主要使用短读长技术，但他认为完整组装的未来属于长读长。

组装工具

文章也提到了一些常用的组装工具，如 Falcon、Canu、wtdbg2 等。不过在 HiFi reads 出现后，人们则主要采用 HiCanu 和 hifiasm 工具来进行基因组组装。此外，PacBio 的 IPA 也是专为 HiFi reads 而优化的组装工具。

hifiasm 的开发者 Heng Li 也是 T2T 联盟的成员之一。他认为，准确的长读长技术正在帮助人们解析单倍型。“没多少人意识到我们今天产生的 hifiasm/HiCanu 组装的质量比一年前高多了，简直就是白天和黑夜的区别。” 他表示：“组装领域的目标是实现二倍体样本的从端粒到端粒组装，然后是多倍体基因组和宏基因组，它们更难组装。”

泛基因组和宏基因组

如今，人们已经不再满足于个人基因组研究，而是转向了人类泛基因组（pangenome）研究，即人类群体基因序列的总和。研究人员认为，高度精确的从端粒到端粒组装可更好地了解人类的多样性以及对当地环境的适应。最近涌现出的许多软件工具可帮助人们从组装结果中找到基因组差异。

对于宏基因组分析，研究人员往往将 Illumina 短片段与 Oxford Nanopore 长片段结合起来，并采用 metaSPAdes 和 metaFlye 等工具进行组装。利用这种方法，人们发现的细菌和古细菌数量增加了一倍以上，且数据表现出更大的系统发育多样性。

总的来说，作者认为，高精度的长读长测序正在大大促进基因组组装项目。（生物通薄荷）

原文检索

Marx, V. Long road to long-read assembly. Nat Methods (2021). https://doi.org/10.1038/s41592-021-01057-y

来源：生物360

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