长读长测序揭示宫颈癌中HPV高分辨率整合及其致癌进展
HPV（人类乳突病毒）整合入人类基因组，往往被认为是宫颈癌发展的重要环节之一，但具体的整合位置和机制目前尚未完全被揭示清楚。在本文中，来自浙大医学院附属邵逸夫医院和附属妇产科医院、华中科技大学和温州中心医院等单位的研究者采用Nanopore测序技术，对16 例HPV16阳性的宫颈肿瘤样品进行大规模检测，重点关注 病毒-人基因组整合事件；相关成果发表在Nature Communications杂志上（文章题为Long-read sequencing unveils high-resolution HPV integration and its oncogenic progression in cervical cancer ）。
文章中，作者结合长读长测序独有的技术特点，根据HPVDNA片段整合情况不同，鉴定出了4个不同的整合类型；此外，作者还发现多个整合位点具有相似的断点位置（共享断点），这会导致染色体内的转位突变和染色体外病毒-人类基因组环状杂交结构的形成。最终作者解析了HPV整合与其多样的结构变异之间的空间关联，同时也阐述了其在宫颈癌中的功能性结果。
结果展示
1、HPV和人类基因组整合断点结果示意
图a：HPV16基因组不同基因区域，插入到人类基因组位置示意图 ；由此图可知，HPV16 基因组对应的E1 和E2 基因，是整合位置最多的两个基因
图b：HPV16基因组断点位置数量统计图 ；直观反映图a结果
图c：在人类基因组中的插入位置示意图，往往存在成簇的情况 ；ZLR-N代表不同的16 个样品，由此图可知，不同样品插入位置成簇的情况各不相同。
2、四种不同类型的整合情况示意图
A型：缺少部分区域的HPV基因组，整合进人类基因组，但该区段仍含有E6/E7基因片段
B型：缺少部分区域的HPV基因组，整合进人类基因组，但该区段不含有E6/E7基因片段
C型：完整HPV基因组和部分其它片段，整合进人类基因组
D型：整合不同片段的HPV基因组至人类基因组中，片段相互之间存在连接序列片段
3、依据上述分型方案对不同样品整合情况进行细化
左侧表示不同样品，由示意图可知，某个样品的整合事件可能是单一的，但也可能多种多样。其中，Amp表示存在一定的片段扩增情况。样品后缀“e”表示某样品不止一种类型的整合事件，数字代表具体数量。
4、某些样品中，整合位置存在共享的情况
HPV插入位点，存在共享的情况，即 不同插入事件，存在相同整合位点的情况。
图a：在样品ZLR-08中，整合位点在同一染色体区域。HPV基因组片段插入至同一染色体中，且一端插入位点相同。
图b、c：在ZLR-11和ZLR12样品中，整合位点不在同一染色体区域。HPV基因组片段两端整合至不同染色体，这种情况下，可能因HPV基因组插入导致染色体间的易位突变。
5、染色体外人类-病毒基因组环状嵌合结构
图a：从获得的嵌合序列（chimeric read）来看，可能存在一个特殊环状DNA结构；该结构中含有来自宿主基因组的片段（序列为颠倒序列）；也有来自HPV基因组的序列。
图b：根据测序所得嵌合read初步勾画的eccDNA结构示意图。
图c：以核酸外切酶对所得核酸样品进行长达5天的消化；一段线性DNA作为阴性对照（消化完全），一段质粒DNA作为阳性对照（难以被消化）；再以特定的引物进行PCR扩增，图c为电泳结果图。其中，E2、H1和H4为对应HPV和人基因组的扩增区域；L2、H2、J1、J2和H3为eccDNA的扩增区域。
6、推测锁定可能的驱动基因（driver gene）LENG9，并进行验证实验
图a：所测序列碱基覆盖度对比情况，图中显示仅LENG9基因为完整高深度覆盖，表明其可能存在较高表达。
图b：癌与癌旁组织中基因表达水平的差异，LENG9基因在癌组织中高表达。
图c：在两个宫颈癌细胞系中过表达LENG9基因，并进行定量PCR和蛋白表达的验证实验。
图d/ e/f：过表达LENG9基因后，细胞的增殖速率、迁移水平和侵袭水平均有显著的提升。
*补充材料中，作者进行了 LENG9 基因敲除实验，敲除后，细胞增殖、迁移和侵袭水平均有所下降。
上述实验结果表明，LENG9基因在HPV16 基因组整合至人基因组后，出现了一定程度的变化，该基因可能在宫颈癌的发生和发展过程中具有重要的作用，可能是一个 潜在的驱动基因。
结论
长读长Nanopore测序，能够很好地展现HPV基因组插入导致的宿主基因组变化，基于长读长测序的技术特点，作者从测序结果中得出以下结论：
1、宿主基因组中，HPV基因组整合位点往往成簇存在；
2、同一整合位点下，可能同时存在各类不同的整合变异事件；
3、长读长鉴定了一系列的染色体间易位变异；
4、HPV基因组可能充当“剪刀”的角色，将宿主基因组一部分与HPV基因组一部分整合成eccDNA结构，而这些特殊结构可能在癌症发生、发展过程中具有重要的作用。
结合测序实验结果，作者进行了一系列的细胞生物学实验，总体实验结果表明，HPV基因插入宿主基因组会引起一系列功能性的变化，作者从中筛选到，LENG9基因可能是宫颈癌发生过程中重要的驱动基因（driver gene）。
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