DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一,可能存在于所有高等生物中。
DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶,N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鸟嘌呤。
原核生物中CCA/TGG和GATC常被甲基化，而真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶。DNA的甲基化是在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶转变为5'甲基胞嘧啶。
这种DNA 修饰方式并没有改变基因序列，但是它调控了基因的表达。脊椎动物基因的甲基化状态有三种：持续的低甲基化状态；高度甲基化状态；去甲基化状态。
CpG岛是什么？
基因的启动子区域5’端非翻译区和第一个外显子区，CpG序列密度非常高，超过均值5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，称之为CpG岛富含CpG区域，长度200bp~1kb，GC含量超过55%.
一般情况下与甲基化研究最密切的就是肿瘤这一块，让我们看看两者有什么样联系吧。
DNA甲基化发生与肿瘤发生
关于技术原理：
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而发生甲基化的胞嘧啶不变。根据某一待测位点或者调查的某一区域序列设计引物进行PCR扩增，通过PCR电泳、测序、荧光定量及NGS等方法对扩增产物进行检测，根据检测结果分析哪些位点发生了甲基化及其甲基化的频率。
关于亚硫酸氢盐测序法
即：Bisulfite Sequencing PCR，BSP
针对客户要调查的DNA区域设计BSP引物进行PCR扩增，将扩增产物克隆后提取阳性克隆进行测序，最后对测序结果进行分析。BSP法方案：
①BSP引物设计：针对目的基因区域进行BSP引物的设计（扩增产物300 bp左右）。
②亚硫酸氢盐处理样品基因组：基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理。
③PCR：扩增客户感兴趣的区域。
④克隆到载体：将PCR产物纯化后连接到常用载体上。
⑤抽质粒测序：挑取10个阳性菌斑接菌培养，抽质粒并测序。
关于BSP法流程：
甲基化CPG岛预测
↓
甲基化引物设计、合成
↓
基因组DNA提取
↓
亚硫酸氢盐处理
↓
甲基化特异PCR扩增
↓
连接克隆
↓
抽质粒测序
↓
结果分析
要求：
客户提供要调查的基因名称或基因ID、种属；
客户提供要调查的甲基化区域或某些位点；
客户提供要出现在报告里样品的编号；
所有样品建议干冰寄送，至少冰袋运输，保持低温，保证样品质量
关于送样要求：
• 细胞≥10^6个
• 组织≥100mg （黄豆大小）
• 全血≥0.5mL
• ≥基因组50ng/uL 20uL
• 口腔拭子≥ 2根，唾液≥0.5mL
• 石蜡切片≥ 3片
关于我们的结果
- 本文固定链接: https://www.maimengkong.com/learn/795.html
- 转载请注明: : 萌小白 2021年11月4日 于 卖萌控的博客 发表
- 百度已收录
