一文看懂RT-qPCR - 卖萌控的博客

起始材料：RNA

定量逆转录PCR（quantitative reverse tranion PCR, RT-qPCR）是应用于以RNA作为起始材料的PCR实验中的一种实验方法。 在该方法中，总RNA或信使RNA（mRNA）首先通过逆转录酶转录成互补DNA（cDNA）。随后，以cDNA为模板进行qPCR反应。RT-qPCR已被用于多种分子生物学的应用中，其中包括基因表达分析、RNA干扰验证、微阵列验证、病原体检测、基因测试和疾病研究。

RT-qPCR的一步法与两步法

RT-qPCR可通过一步法或两步法来完成。一步法RT-qPCR把逆转录与PCR扩增结合在一起，使逆转录酶与DNA聚合酶在 同一管内同样缓冲液条件下完成反应。一步法RT-qPCR只需要利用序列特异性引物。在两步法RT-qPCR中，逆转录和PCR扩增过程是在 两个管中完成，使用不同的优化的缓冲液、反应条件、以及引物设计策略。

	优点	缺点
一步法	由于两步反应都在一个管中完成，因此该方法具有更少的实验误差更少的移液步骤能够减少污染的风险适用于高通量扩增/筛选，快速且可重现性高	无法分别对两步反应进行优化由于反应条件是结合两步反应折衷得到的，因此灵敏性不如两步法单一样品检测的靶点数较少
两步法	能够建立可以长期保存，并用于多次反应的稳定的cDNA库靶基因和内参基因能够从同一个cDNA库进行扩增，而不需要多重cDNA库能够优化单一反应过程的反应缓冲液和反应条件灵活的引发条件选择	使用多个试管，以及更多的移液步骤会增加DNA污染的风险, 并且耗时。相较于一步法，需要进行更多的优化

总RNA与mRNA的选择

在设计RT-qPCR实验过程中，决定是否要使用总RNA或纯化的mRNA作为模板进行逆转录十分重要。尽管mRNA可能能够提供略高的灵敏度，但总RNA仍经常使用。其原因是 总RNA作为起始材料具有较mRNA更重要的优势。首先，其过程需要较少的纯化步骤，这确保了更好的定量回收模板和更好的把结果标准化为起始的细胞数。其次，其避免mRNA富集步骤，这能够避免由于不同mRNA的回收率不同而带来的结果偏移的可能性。总的来说，由于在大多数的应用中，目标基因的相对定量比检测的绝对灵敏度更为重要，因此在大多数情况下，总RNA更适用。

逆转录引物

在两步法中，有 三种不同的方法可用于引发cDNA反应：oligo(dT)引物、随机引物、或序列特异性引物。通常情况下，是将oligo(dT)引物和随机引物进行混合使用。这些引物退火至模板mRNA链，并提供给逆转录酶一个用于合成的起点位置。

引物选择	结构与功能	优点	缺点
Oligo(dT) 引物（或锚定 oligo(dT) 引物）	延展退火至 mRNA poly(A) 尾部的胸腺嘧啶残基；锚定 oligo(dT) 引物的3’端包含一个G、C或A （锚定位点）	利用连接有 poly(A) 尾的 mRNA 合成全长的 cDNA 适用于可利用起始原料较少的情况锚定位点能够确保 oligo(dT) 引物结合至 mRNA 5’ 端 poly(A) 尾部	只适用于扩增带有 poly(A) 尾的基因得到从 poly(A) 内引发位点2处截断的 cDNA 偏向与3’端结合 *若使用锚定 oligo(dT) 引物将最小化这一可能
随机引物	长度为6至9个碱基，在 RNA 转录过程中，其可退火至多个位点	可退火至所有 RNA（tRNA、rRNA、以及 mRNA）适用于转录产物具有显著二级结构，或者可利用起始原料较少的情况高 cDNA 产量	cDNA 是由所有的 RNA 逆转录得到，通常不是想要的，并可能稀释目标 mRNA 的信号得到截断的 cDNA
序列特异性引物	靶向特异的 mRNA 序列的定制引物	特异的 cDNA 库提高灵敏度使用反向 qPCR 引物	只限定在单个目的基因的合成

逆转录酶

逆转录酶是利用 RNA合成DNA的一种酶。 一部分逆转录酶具有RNA酶活性，能够在转录后降解RNA-DNA杂交链中的RNA链。如果其不具有Rnase酶活性，可加入RNaseH以获得更高的qPCR效率。常用的酶包括莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶和禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶。对于RT-qPCR来说，理想的情况下是选择具有较高热稳定性的逆转录酶，这样cDNA的合成能够在较高的温度下进行，确保成功转录具有较高二级结构的RNA，同时保持其在整个反应过程中的全部活性，从而得到更高的cDNA 产量。

逆转录酶的RNase H活性

RNaseH能够 从RNA-DNA双链中降解RNA链，从而允许双链DNA的有效合成。然而，当使用长mRNA作为模板，RNA可能被过早的降解，从而导致截短的cDNA。因此，在cDNA克隆过程中，如果需要合成长的转录物时，尽量减小 RNaseH的活性通常是有益的。与此相反，拥有RNase H活性的逆转录酶通常有利于qPCR的应用，因为它们能够在PCR的第一个循环中提高RNA-DNA双链的熔解。

引物设计

用于RT-qPCR中qPCR步骤的PCR引物 最好应设计成跨越一个外显子-外显子连接，其中一条扩增引物可以潜在地跨越实际外显子-内含子边界。由于含内含子的基因组DNA序列不会被扩增，因此这种设计可以减少从污染的基因组DNA中扩增得到的假阳性的风险。

如果引物不能被设计成能够分离外显子或外显子-外显子边界，则有必要利用无 RNA酶的DNA酶I或dsDNA酶处理RNA样品以除去基因组DNA 污染。

RT-qPCR对照

一个逆转录阴性对照（-RT对照）应该包括在所有的RT-qPCR的实验中， 以检测 DNA污染（如基因组 DNA 或来自之前反应的PCR 产物）。这一对照包含除逆转录酶之外的所有反应组分。由于该对照不会发生逆转录，因此如果观察到 PCR扩增，则极有可能来自DNA的污染。